2022年11月10日，中国科学院上海药物研究所徐华强/庄友文团队、谢欣团队和王明伟团队等合作在国际顶级期刊Cell上以长文形式在线发表了题为“Molecular recognition of morphine and fentanyl by the human -opioid receptor”的研究论文。该项研究解析并报道了芬太尼、吗啡及Oliceridine等阿片类镇痛药物分别激活 型阿片受体（ OR）的高分辨率三维结构，首次揭示了芬太尼和吗啡识别并激活 OR的作用机制。该研究进一步结合多种细胞水平功能分析和分子动力学模拟等方法，阐明了芬太尼系列衍生物与药靶 OR相互作用的构效关系以及 OR介导阻遏蛋白（Arrestin）信号的关键结构基础等，系统地发掘和深化了对于 OR信号传导调控机理的理解和认识，为推动开发新型高效低毒的阿片类镇痛药物指明了方向。

　　疼痛，尤其是慢性疼痛，是一类常见的神经系统疾病。疼痛的影响群体广泛，据统计，全球有近20%的成年人受到慢性疼痛的困扰，在一些经济相对落后的国家更是高达近40%。常见的慢性疼痛包括腰背疼痛、关节炎疼痛、偏头痛以及癌痛等，不仅导致行为能力的减弱或丧失，同时也带来抑郁、睡眠障碍和自杀倾向等后果，严重影响人们的身心健康，同时造成了巨大的社会和经济负担。

图1. 罂粟（https://unsplash.com/）

　　阿片类药物是目前应用最为广泛且高效的镇痛药物。人类对于阿片类药物的应用可以追溯到几千年之前将植物罂粟用于镇痛镇静和娱乐用途（产生愉悦与欣快感）。随后研究发现，阿片类药物吗啡是罂粟里面发挥活性的主要物质。常见的阿片类药物有天然阿片类生物碱如吗啡和可卡因，以及人工合成的阿片类药物杜冷丁和芬太尼等，合成的阿片类药物在人体内产生吗啡样效应。阿片类药物通过作用于G蛋白偶联受体家族中的阿片受体，尤其是 型阿片受体（ opioid receptor, OR），主要激活下游抑制性Gi/o蛋白从而发挥镇痛等药理活性。靶向阿片受体药物的开发长期以来是镇痛药物研究的热点，已经上市的阿片类药物大多为 OR的激动剂，具有代表性的经典阿片类镇痛药物如吗啡和芬太尼均表现出对 OR的高度选择性。然而，阿片类镇痛药物的使用会导致诸多毒副作用，包括成瘾、呼吸抑制和便秘等，极大限制了其临床应用，也使靶向阿片受体安全有效的镇痛药物之开发成为一大难点。阿片类药物成瘾引起的呼吸抑制致死也直接促使了广泛扩散的“阿片危机”的产生，主要集中在北美和加拿大等地，每年造成超10万人死亡，这主要是由于芬太尼及其衍生物的滥用所引起。作为“阿片危机”的主要产生因素以及目前临床仍在使用的一个强效镇痛药物，芬太尼与其受体 OR相互作用的分子机制长期处于未知状态，阐明相关分子机制对于我们合理设计更为安全且高效的芬太尼衍生物类镇痛药意义重大。

图2. 药物成瘾 (www.shutterstock.com)

　　前期研究表明，阿片类药物产生的镇痛效应是通过 OR的G蛋白信号通路介导的，而其副作用则由Arrestin信号通路所引起。然而，最近多项研究对该假说提出质疑，认为呼吸抑制等神经毒副作用和Arrestin信号无关1。尽管质疑存在，前期仍有大量的研究投入到G蛋白偏向性的 OR激动剂药物开发上，旨在发现高效低毒的靶向 OR镇痛药物2。2020年，美国FDA批准了首个，也是目前为止唯一一个基于G蛋白偏向性理念设计出来的靶向 OR镇痛药Oliceridine（TRV130）用于中度到重度疼痛治疗，该药物表现出比吗啡更低的毒副作用。由于对 OR的G蛋白偏好性分子机制缺乏认识，自上述假说提出近20多年以来， OR的G蛋白偏向性激动剂的发现均通过大规模高通量盲筛获得，极大阻碍了同类创新性镇痛药物的合理设计和发现。

　　本项研究中，研究人员首先通过冷冻电镜技术分别解析了人源 OR结合芬太尼、吗啡和DAMGO等平衡性激动剂（表现出G蛋白和Arrestin双向信号活性）以及TRV130、SR17018及PZM21等G蛋白偏向性激动剂的三维结构，并进一步通过分子动力学模拟以及细胞水平功能分析对不同信号活性激动剂活化下 OR的信号传导特性进行表征。研究发现，相比于吗啡，芬太尼在 OR的TM2至TM3近胞外端占据额外的结合口袋，此外，芬太尼的苯胺环侧链与氨基酸残基W295和Y328形成直接的 - 疏水相互作用，这赋予了其比吗啡高达50-100倍的受体激活活性。通过对不同芬太尼衍生物的分子对接和点突变功能验证，研究人员进一步探索了芬太尼及其衍生物与 OR的构效关系，发现药物分子与D149、Y150、W135和W320等氨基酸残基不同程度的互作在决定芬太尼及其衍生物（卡芬太尼、苏芬太尼和羟甲芬太尼等）不同活性上发挥关键作用。对解析的系列结构比对分析以及分子动力学模拟发现，G蛋白偏向性激动剂PZM21等更倾向于结合 OR配体结合口袋的TM2/3一侧，而平衡性激动剂芬太尼等则表现出与 OR跨膜区更为广泛均衡的相互作用，并且使得 OR的胞内端结构域更为紧缩，这有利于 OR与Arrestin的结合，从而解释了平衡性激动剂表现Arrestin活性的分子机理。基于这些发现，研究人员还基于芬太尼分子骨架设计了不同活性的新型G蛋白偏向性芬太尼衍生物FBD1和FBD3。

图3. 不同化学结构阿片类药物结合人源 OR的结构。左上：芬太尼和吗啡的不同结合模式；左下：芬太尼及其衍生物与 OR相互作用的构效分析；右上：在分子动力学模拟中， OR的平衡性激动剂相比于G蛋白偏向性激动剂介导更为紧缩的胞内腔构象；右下：基于结构设计的不同活性的新型G蛋白偏向性芬太尼衍生物FBD1和FBD3。中间：减弱配体和 OR的TM6/7的相互作用引起 OR信号偏向性。

　　本研究由上海药物所徐华强/庄友文团队、谢欣团队和王明伟团队通力合作完成。中国科学院上海药物所副研究员庄友文、博士研究生王悦、何冰清和何欣恒为该论文的共同第一作者。上海药物所徐华强研究员、谢欣研究员和庄友文副研究员，以及复旦大学基础医学院药理学系王明伟教授为论文的共同通讯作者。参与本次研究的还有上海药物所程曦研究员、杨德华研究员、蒋轶研究员、蒋翔锐研究员、郭世猛博士，上海药物所、复旦大学和上海科技大学联合培养研究生饶启迪，复旦大学基础医学院周庆同研究员，以及美国温安洛研究所Karsten Melcher教授和X.Edward Zhou博士等。研究工作同时得到了上海药物所蒋华良院士和沈敬山研究员的大力支持和帮助。上海原思标物科技公司为本项研究提供了化合物样品。该工作得到了上海药物所冷冻电镜平台和上海药物所高峰电镜平台的技术支持，获得了国家自然科学基金委、科技部重点研发计划、中科院先导项目、国家科技重大专项（新药创制重点项目）、上海市科技重大专项和中科院特别助理研究项目等的经费资助。

　　文章链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.09.041

　　参考文献：

　　1.zevedo Neto, J. et al. Biased versus Partial Agonism in the Search for Safer Opioid Analgesics. Molecules 25, 3870, doi:10.3390/molecules25173870 (2020).

　　2.Che, T., Dwivedi-Agnihotri, H., Shukla, A. K. & Roth, B. L. Biased ligands at opioid receptors: Current status and future directions. Sci Signal 14, doi:10.1126/scisignal.aav0320 (2021).

专家点评：

　　张旭（中国科学院院士）

　　疼痛是一种病理机制复杂多样的神经精神类疾病，据2020年中国疼痛医学发展报告显示，我国有近10%-20%的人群受到包括癌性疼痛、术后疼痛、神经损伤和肌肉纤维疼痛等在内的慢性疼痛困扰，慢性疼痛患者群体已超过3亿人，且仍在不断增长。疼痛已发展成当前社会继癌症和心脑血管疾病之后的第三重大健康问题，对人们的生活以及社会经济发展造成了巨大的影响和负担，开发高效且安全的镇痛药是当前医疗卫生的重大需求。

　　阿片类药物是目前应用最为广泛和有效的镇痛药物。人类最早对阿片类药物的使用体现在对植物罂粟的价值发掘。作为一种古老的药用植物，罂粟早在公元前 4000 年左右的苏美尔文字中便被提及，被称为Hul Gil（令人欢乐的植物）。鸦片是从罂粟中提取的一类生物碱类活性物质，其在人类历史中的应用可以追溯到几千年之前，主要用于镇痛治疗和消遣娱乐。鸦片中核心活性物质是吗啡，以希腊梦之神莫菲斯（Morpheus）命名，在1805年由德国药剂师Friedrich Sert rner首次从鸦片中分离提取获得。吗啡具有强效的镇痛效果，与此同时也伴随着高度成瘾和呼吸抑制等毒副反应。在追求强效、低成瘾的镇痛药道路上，一系列结构各异的产生吗啡样生理效应的阿片类药物相继被合成出，其中便包括1874年发现的海洛因和1959年被合成出的芬太尼等。虽然这些合成的阿片类药物比天然阿片生物碱吗啡表现出更强的镇痛效果，但是也伴随这更为强烈的毒副作用。设计并开发高效镇痛且规避神经毒副作用的新型阿片类镇痛药物甚至非阿片类镇痛药一直是科学家的不懈追求。

　　阿片类药物通过模拟内源性阿片肽，如内啡肽、强啡肽等的抗伤害感受生理作用，激活G蛋白偶联受体家族中的阿片受体发挥镇痛效应。其中，吗啡和芬太尼作为经典的阿片类镇痛药的代表，主要通过激活 型阿片受体（ opioid receptor, OR）发挥作用，至今仍作为临床用镇痛药物。长期以来，大量的研究集中在两者如何和 OR结合的科学问题上，以期根据结构信息设计出更为安全的阿片类镇痛药，尤其是在2012年首个 OR的（非激活态）结构被解析出来之后。然而，基于分子对接和动力学模拟得出的激动剂结合模型错综复杂，无法反应真实激动剂的结合模式。这项研究首次解析了激动剂吗啡和芬太尼结合 OR的系列近原子分辨率结构，澄清了对芬太尼结合模式混乱的认识，让我们第一次认识了它如何与 OR相互作用，对未来止痛药的设计提供了精确的模板。 OR介导的arrestin信号通路被认为是阿片类药物毒副反应发生的重要因素，这也促使了G蛋白偏向性配体TRV130的发现并于2020年被FDA批准上市。这项研究也基于结构及多种药理功能实验发现减弱阿片类药物分子与 OR的第六、第七跨膜区域相互作用即可减弱甚至消除arrestin信号从而引发G蛋白偏向性信号转导，这一重要发现为后续设计发现具有通路偏向性的阿片类药物提供了新思路，将促进高效、成瘾性低的镇痛药的发现。

　　中科院上海药物所在镇痛药物作用机理和新药发现上历史悠久，做出了一系列重要的发现和贡献。药物所第一任所长赵承嘏先生和金国章先生分别对中药延胡索中的镇痛药四氢巴马汀进行了提纯和系统性药理作用研究。药物所邹冈先生对吗啡作用机理、神经肽药理等进行了深入细致的研究，证实了吗啡镇痛的有效作用部位是第三脑室和大脑导水管周围中央灰质，该成果被誉为吗啡作用机理研究的“里程碑”。药物所池志强先生长期从事靶向阿片受体神经药理和镇痛剂研究，领导发现了高强效的镇痛剂羟甲芬太尼(Ohmefentanyl)。这项研究也是药物所在阿片受体镇痛药物研究方向的良好传承。

　　裴钢 （中国科学院院士）

　　阿片受体作为临床镇痛药物最重要的靶标分子，它的相关研究非常必要。最近上海药物所徐华强研究员、谢欣研究员、王明伟研究员以及庄友文副研究员联合多个团队在 型阿片受体识别芬太尼、吗啡等药物分子的机制研究方面取得了重要进展，相关工作发表在《Cell》上。阿片受体被配体激活之后，主要介导下游两条信号通路，即G蛋白和 -arrestin信号通路，达到镇痛的效果，但也伴随着成瘾、呼吸抑制、便秘等副作用。目前领域内有很多研究提示镇痛效果主要由G蛋白信号通路介导，而副作用由 -arrestin通路介导。尽管也有不少实验并不支持上述观察，但很多科学家仍致力于G蛋白通路偏好性药物的研究，其中G蛋白通路偏好性配体TRV130在2020年被美国FDA批准上市，用于治疗成年人的中至重度急性疼痛，但仍以“黑框警告”的形式强调了它依然存在的副作用，此乃“知其然，不知其所以然”。

　　本文系统阐释了阿片受体结合偏好性药物和非偏好性药物的模式，并且突破性地找到了介导两条信号通路的关键结合特征。两种类型的配体都与前面跨膜螺旋有较强的相互作用，而相比于芬太尼和吗啡这样的非偏好性配体，偏好性配体与后面跨膜螺旋相互作用较弱。这些结果不仅在细胞水平和分子动力学模拟上得到了验证，作者也基于结构生物学提供的机制，精准地对芬太尼进行了改造，合成了FBD1和FBD3两个具有G蛋白通路偏好性的衍生物，进一步证实了偏好性关键位点的理念。这些结构让我们对阿片受体的通路选择机制“知其然，也知其所以然”。但是自然界的生物规律是非常复杂和多元的，我期待这种产生偏好性的机制及潜在阿片受体调节剂的功效等在动物水平上的进一步验证。

　　随着结构生物学的发展，我国科研人员不仅通过生物化学结合计算机等多学科手段解析生物大分子的结构，而且更进一步从这些结构出发，积极探索解决生命科学与生物医学前沿领域中的重大问题和急迫需求。这篇发表在《Cell》上的工作就是一个很好的转化研究的例子，产出的成果不仅推动了对阿片类药物分子机制的理解，也为基于结构的药物设计和研发奠定了基石。