2024年11月22日，中国科学院上海药物研究所陆晓杰团队联合许叶春团队在Journal of the American Chemical Society上发表了题为 “Covalent DNA-Encoded Library Workflow Drives Discovery of SARS-CoV-2 Non-structural Protein Inhibitors” 的文章。该研究开发了共价DNA编码化合物库工作流，实现对新冠病毒中富含半胱氨酸的系列非结构蛋白的共价筛选，鉴定出具有新颖骨架和结合在变构活性位点的共价苗头化合物。

共价抑制剂是一类能够与靶蛋白中的亲核性氨基酸残基（如半胱氨酸）形成共价键的小分子化合物。通过这种特殊的相互作用，这类抑制剂具有提高效力、延长作用时间以及在针对独特结合位点或反应性残基时实现高度选择性的优势。

共价抑制剂已在药物开发中取得重要进展，被成功应用于多种疾病靶点的治疗。目前共价抑制剂的通量筛选方法主要依赖于商业化的共价片段库以及基于活性的蛋白质组学分析（ABPP）技术。例如，陆晓杰团队联合谭敏佳团队和复旦大学周璐团队将ABPP与CoDEL结合实现对酪氨酸残基的共价筛选（J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 25283−25292）。

DNA编码化合物库（DEL）技术具有高通量、低成本、样品需求量少、筛选效率高等特点，已经逐渐发展成为新兴的药物筛选领域的常用筛选技术。然而DEL常规的可逆筛选通常得到的是与靶标具有结合力的可逆分子，然其否具有调控蛋白生物活性的功能仍有待进一步验证。

针对以上问题，研究人员以SARS-CoV-2非结构蛋白为筛选目标，通过对系列非结构蛋白的结构分析，最终选择以具有重要功能的SARS-CoV-2 Nsp3（PL^pro），Nsp5（3CL^pro）以及Nsp7/8/12复合物为靶标进行筛选验证。考虑到靶标中可共价残基的位置处于口袋深处研究人员在共价DEL构建过程中将共价接头部分作为最后一轮反应砌块引入，从而实现共价DEL的选择性、合理化设计。

在本研究中，研究人员通过将野生型和催化残基（Cys）突变的非结构蛋白进行对比筛选，从而选择性地鉴定出与催化位点相结合的共价抑制剂；随后，通过合成On-DNA化合物凝胶电泳分析和复合物晶体结构解析手段进一步验证了苗头化合物与靶标半胱氨酸反应位点和结合模式。其中，首次报道了SARS-CoV-2 PL^pro底物结合口袋外的别构位点，并通过相似库分析建立IC₅₀值与标准化的富集度之间的关联，实现对不同结构的活性预测。对于SARS-CoV-2 3CL^pro靶点，由于筛选过程DEL库中的分子带有一段核酸链，而分子与核酸连接的位置暴露在溶剂区域，因此研究人员先通过共价对接手段，通过引入构象限制，从而实现精准的对接分析，后续解析的蛋白-配体复合物晶体结构确证了该方法的适用性。最后，针对Nsp7/8/12同样进行凝胶电泳共价分析，并通过QM/MM模拟揭示了潜在共价结合位点。

上海药物所博士研究生王旭东、杭州高等研究院硕士研究生熊丽伟、南京中医药大学联合培养硕士朱英和上海药物所博士研究生刘思秀为本文共同第一作者；上海药物所陆晓杰研究员、许叶春课题组胡杭晨副研究员、中科苏州药物研究院梅良和博士为本文共同通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金，上海市创新行动计划自然科学基金，上海药物所自主部署科研项目基金，中国科学院B类先导专项的资助。

全文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c12992