2025年4月8日，中国科学院上海药物研究所许叶春研究团队联合武汉病毒研究所张磊砢团队在Advanced Science在线发表了题为“Dynamic Cap-Mediated Substrate Access and Potent Inhibitor Design of Monkeypox Virus I7L Protease”的研究论文。该论文首次报道了猴痘病毒I7L蛋白酶的高分辨率晶体结构，揭示其独特的构象调控机制，并基于此成功设计和优化获得纳摩尔级共价抑制剂，为正痘病毒的广谱抗病毒药物开发提供了结构基础和先导化合物。

猴痘病毒是一种长期在非洲流行的正痘病毒，因2022年引起全球暴发而被世界卫生组织列为全球公共卫生紧急事件。I7L蛋白酶在正痘病毒成熟过程中发挥关键作用，是备受关注的抗病毒药物新靶点。然而，长期以来其底物识别机制不明、三维结构缺失、酶活检测方法匮乏，严重妨碍了I7L抑制剂的研发进展。

首次报道猴痘病毒I7L蛋白酶晶体结构，揭示“构象开关”机制

本项研究中，研究团队解析了猴痘病毒I7L蛋白酶高分辨率晶体结构，发现其以稳定的二聚体形式存在，具备高度保守的催化三联体。在活性位点附近，团队首次解析并捕捉到一个柔性的帽状结构区域（cap region），可在“开启”与“闭合”两种构象间发生动态转换，有效调控底物进入活性中心。结合多个晶体结构的解析和分子动力学模拟研究，证实该帽状结构作为I7L蛋白酶中的“构象开关”，在底物结合过程中发挥核心调节作用。该研究不仅填补了正痘病毒蛋白酶三维结构研究的空白，更在原子层面为基于结构的精准药物研发提供了全新思路。

图1. 猴痘病毒I7L蛋白酶晶体结构及帽状结构区域的动态构象调控机制

（a）猴痘病毒I7L蛋白酶二聚体。（b）晶体结构捕捉到的帽状结构区域的两种不同构象。（c）分子动力学模拟揭示的I7L蛋白酶的构象分布。（d）I7L蛋白酶的帽状结构调控底物结合示意图。

阐明I7L蛋白酶底物识别与催化水解机制，设计强效抑制剂

在结构解析基础上，研究团队结合AlphaFold3复合物结构预测与QM/MM 分子动力学多尺度模拟，系统揭示了I7L蛋白酶的底物识别规律和催化水解机制，明确了I7L蛋白酶S1–S5亚位点的关键作用，并揭示去酰化（E-1 → E:P）为催化反应的限速步骤。

图2. 猴痘病毒I7L蛋白酶底物识别与催化反应的分子机制

（a）猴痘病毒的底物序列（P5–P2'）及保守性分析。（b）AlphaFold3预测底物M4R-1与猴痘病毒I7L蛋白酶的结合模式。（c）基于QM/MM 分子动力学模拟计算揭示的猴痘病毒I7L蛋白酶催化水解底物机制。

基于上述机制解析，研究团队进一步设计了模拟天然底物的一系列共价抑制剂，采用临床应用共价药物中的氰基作为共价弹头，并建立了基于荧光共振能量转移（FRET）的高通量酶活测试方法进行化合物的抑制活性评价，成功鉴定出多个具有纳摩尔级抑制活性的I7L抑制剂。其中，化合物11展现出卓越的抑制活性，它在酶水平抑制猴痘病毒I7L蛋白酶的IC₅₀为69 nM。在细胞水平，化合物11有效抑制痘苗病毒复制，EC₅₀为6.0 μM，且在400 μM浓度下未观察到明显的细胞毒性（CC₅₀ > 400 μM）。

图3. 基于结构的猴痘病毒I7L蛋白酶抑制剂的设计

进一步多序列比对分析揭示，I7L蛋白酶在正痘病毒属中呈现跨物种高度保守，且在猴痘病毒不同进化分支（clade I、IIa、IIb）间同样保持极高的序列一致性。结构分析显示关键的药物结合位点无突变，提示研究团队所开发的抑制剂具备广谱抗正痘病毒的潜力。

许叶春研究团队长期致力于靶向病毒蛋白酶的广谱抗病毒药物研发，构建了结构药理学与计算机辅助药物设计深度融合的早期药物发现关键技术体系。团队以精准解析的药效构象为基础，理性设计并高效优化获得先导化合物及候选药物，其中包括已获批上市的抗新冠病毒创新药物。此外，研究团队近年来在国际顶尖期刊上发表多项创新性的抗病毒相关研究成果（J. Am. Chem. Soc. 2024，Nat. Commun. 2023，Chem. Sci. 2023，Nat. Sci. Rev. 2023，Signal Transduct. Target. Ther. 2023，Angew. Chem. Int. Ed. 2022，Nat. Commun. 2021，Science 2020a，Science 2020b）。

上海药物所苏海霞研究员、临港实验室博士生邬国庆、杭州高等研究院博士后熊慕雅、南京中医药大学/上海药物所联合培养硕士生王宇航、武汉病毒所博士后曹浚垣为本文的共同第一作者，上海药物所许叶春研究员、邵强研究员以及武汉病毒所张磊砢研究员为共同通讯作者。该项工作得到了上海同步辐射光源的支持，获得了国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项、上海药物所自主部署项目、国家重点研发计划、广州国家实验室重大项目和湖北省重点研发计划等项目的支持。

全文链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202501625

（供稿部门：许叶春课题组）