小分子的三维结构决定了配体与蛋白质相互作用的选择性，因此复杂手性分子的立体异构体通常具有不同的生物活性，有时甚至表现完全相反的药理作用。在过去的几十年中，不对称催化技术取得了显著进展，可高选择性地合成手性纯的对映异构体。相比而言，高选择性合成目标产物的非对映异构体更具挑战。醛缩酶是一种催化C-C键形成的功能强大的酶，由于其催化的反应通常具有极高的选择性，且不同类型的醛缩酶能与各种亲电试剂和亲核试剂兼容，因此醛缩酶在手性药物和精细化学品的合成中应用广泛。尽管如此，目前利用酶工程调控醛缩酶选择性并应用于非对映异构体多样性合成的研究鲜有报道。

针对上述问题，中国科学院上海药物研究所（上海药物所）廖苍松课题组与中国科学院天津工业生物技术研究所（天津工生所）盛翔课题组合作，利用聚焦理性迭代位点特异性突变（FRISM）策略对脱羧醛缩酶UstD进行了半理性工程改造，调控了UstD对邻位二酮亲电试剂的区域选择性和立体选择性，从而发散式地合成了30 种在α和γ位置具有立体中心的环状亚胺酸分子，同时利用分子动力学模拟方法阐明了不同酶变体的选择性调控机制。相关成果以“Semirational Protein Engineering of Decarboxylative Aldolase for the Regiodivergent and Stereodivergent Synthesis of Cyclic Imino Acids”为题于2025年1月15日在线发表于Angewandte Chemie International Edition。

UstD是一种PLP依赖性醛缩酶，负责抗肿瘤环肽化合物Ustiloxin B生物合成途径的最后一步修饰反应。UstD可以催化 L-天冬氨酸（L-Asp）与多种亲电试剂之间的脱羧羟醛缩合反应，以高效率和高选择性生成具有γ仲醇或叔醇的非天然氨基酸。目前已报道的UstD 亲电试剂包括了醛、酮、靛红、茚二酮和酮酸酯等类型。基于UstD的多样活性和高选择性，研究人员设想是否可以通过改造UstD催化口袋的活性位点，调控UstD对邻位二酮的立体选择性简洁合成铁螯合剂Siderochelins等天然产物的环状亚胺酸骨架，或者调控UstD的区域选择性使烯胺中间体进攻位阻更大的酮羰基（图1）。

研究人员在之前的研究工作中（Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202318550），通过实验和计算相结合的方式阐明了UstD立体选择性和区域选择性的调控机制，发现了Y257和K258对关键烯胺中间体的形成至关重要，而H148则与亲电试剂形成氢键。在本研究中，为提高进化和筛选工作的效率，研究人员使用聚焦理性迭代位点特异性突变（FRISM）的半理性策略开展酶工程改造研究，通过酶变体设计探索底物结合口袋的残基对选择性的调控机制 (图2)。经过三轮突变后得到的UstD2.0_AAM（UstD2.0_{S60A/M299A/T388M}）对产物1c的转化率为46%，选择性为90%，对产物2b的转化率为72%，选择性为94%。研究人员通过2D ROESY实验中 Cα-H 与甲基之间的关键相关性，解析了2b的立体构型。后续研究人员利用ApUstD和UstD2.0_AAM高活性和高立体选择性地合成了共计30种在α和γ位置具有立体中心的环状亚胺酸，并实现了百毫克规模的制备反应，收率高达89%。

为解析本研究中的立体选择性和区域选择性的调控机制，盛翔课题组利用分子动力学（MD）模拟研究了 ApUstD和UstD2.0AAM与底物的结合模式（以1为代表底物）。通过对酶活性口袋残基与底物分子的相互作用分析，研究人员发现ApUstD和UstD2.0_AAM两种酶活性位点空腔大小和疏水性存在明显差异，并提出这些差异导致了底物在口袋内具有不同的结合构象，也是不同酶表现出不同反应选择性的根本原因。

本研究中，上海药物所和天津工生所合作通过理论计算和实验研究结合的方式，利用FRISM策略，针对UstD活性位点的三个关键残基创建了一个小型突变体库，成功调控了UstD的区域选择性和非对映选择性。获得的工程酶变体具有极佳的选择性和较广的底物谱，拓展了环亚胺酸的结构多样性。此外，廖苍松课题组最近还报道了不同的醛缩酶可接受多样性的二酮化合物作为亲电试剂，用于合成多样的含叔醇手性小分子（ChemCatChem 2024, 16, e202400337）。利用FRISM策略改造醛缩酶有望实现其它醛缩酶选择性的精准调控并应用于高价值手性小分子的高效不对称合成。

上海药物所廖苍松研究员、天津工生所盛翔研究员以及上海药物所张睿副研究员为论文共同通讯作者。上海药物所硕士研究生兰羽秋和川北医学院的张成华副教授为论文共同第一作者。本课题的产物结构解析工作得到了上海药物所叶阳研究员和唐春萍高级工程师的合作支持。该研究工作得到国家重点研发计划，国家自然科学基金，广东省重点领域研发计划等项目的资助。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202500080

图1：UstD的多样亲电试剂和选择性

图2：理论计算指导下的UstD工程改造

图3：半理性改造UstD实现环亚胺酸发散合成

（供稿部门：廖苍松课题组 ；供稿人：兰羽秋 ）