糖作为生命体系中三大聚合物分子之一，具有远超核酸和蛋白的复杂结构。实现高效的糖结构鉴定和序列解析是开展糖类物质活性与功能研究的基础，是推动糖科学快速发展的关键环节之一。前期工作中，中国科学院上海药物研究所高召兵联合攻关团队利用基因工程改造后的生物纳米孔描绘了糖官能团的电信号指纹图谱，将纳米孔在糖领域的研究从“糖检测”正式推进至“糖测序”阶段，纳米孔糖测序（nanopore glycan sequencing）已成为研究热点（J. Am. Chem. Soc.，2023，封面文章）。糖的结构极其复杂，具备对复杂聚糖的综合传感能力是实现纳米孔糖测序需要解决的前提之一，然而已有纳米孔均不具备区分复杂聚糖的能力。

近期，上海药物所高召兵/夏冰清（纳米孔方向），文留青（糖化学方向），程曦（计算生物学方向）等组成的联合交叉攻关团队，在前期的工作基础上，设计并构建了一种新型的工程化生物纳米孔。利用该纳米孔，攻关团队取得了糖测序研发进程中的多项进展，第一，首次实现链长达到十糖的复杂聚糖电信号解析，并达到了单糖分辨率；第二，首次实现复杂聚糖分子异构体的区分。特别值得指出的是，更长聚糖虽然因溶解度不佳未开展实验，在无需借助额外适配体和机器学习分析的情况，该技术已可直接区分链长达到十糖的聚糖，显示了该纳米孔设计策略的优势。该工作是生物纳米孔糖测序技术研发进程中又一节点性工作，相关内容于2024年4月11日以“Direct Identification of Complex Glycans via a Highly Sensitive Engineered Nanopore”为题在线发表在Journal of the American Chemical Society上，并被选为封面文章。

图1. JACS 封面（高灵敏度工程化纳米孔直接区分复杂聚糖）

基于前期的工作基础，为进一步优化突变纳米孔α -溶血素（M113R）的检测灵敏度以及检测窗口，攻关团队对M113R进行新一轮的基因工程改造。在保留一级传感位点M113R的基础上，对多个二级位点进行了丙氨酸突变，这有利于在维持信号响应的同时，增大对糖分子链长或体积的检测限。最终筛选获得了一种在大尺寸复杂聚糖传感中表现出较大潜力的工程化纳米孔α -溶血素（M113R/T115A）。利用该突变纳米孔，研究人员首先获得只存在单糖差异的聚糖电信号，表征了聚糖中的单糖结构差异，说明M113R/T115A纳米孔对糖分子结构具备单糖分辨率；其次，研究团队利用M113R/T115A实现了从五糖到十糖的连续检测，对其实现了显著区分，首次将纳米孔对于寡糖的实际读长达到10（因溶解度限制目前仅测到10糖），为实现糖测序打下基础；最后，利用该纳米孔检测了具有不同糖苷键的寡糖异构体，实现了不同链长异构体的区分，区分度达0.9，说明该纳米孔可同时区分多种寡糖的结构差异。进一步通过剖析纳米孔-糖互作模式，阐明了纳米孔高灵敏度鉴定复杂聚糖微小差异的分子机制。该团队提供了一种实现复杂聚糖链长和结构区分的纳米孔设计范式，其单糖分辨率、链长读取能力、异构差异识别等为最终攻克纳米孔糖测序发展过程中多个无法规避的难点提供重要借鉴。

图2. 纳米孔M113R/T115A区分复杂聚糖 

聚糖的结构异质性包括了种类丰富的单糖构建模块、多种形式的糖苷键、长短不一的链长和分支等，这给聚糖分析带来了巨大的挑战。近年来，研究人员在开发基于纳米孔的聚糖鉴定方法方面做出了重大努力。这些工作为最终实现纳米孔糖测序目标提供了宝贵的见解。但迄今为止，该领域仍处于初步阶段。本研究设计的工程化纳米孔提供了一种无适配体、高分辨率的方法，实现了对聚糖结构的多方位识别，并在大尺寸、多官能团、极微差异的复杂聚糖识别上取得突破。

上海药物所/上海科技大学/临港实验室联合培养博士生姚广大，上海药物所田银平博士、博士生柯文军、副研究员夏冰清为本文第一作者；上海药物所/南京中医药大学联合培养博士生方洁，上海药物所博士后马圣洲、研究员李铁海为本文共同作者；上海药物所高召兵研究员、文留青研究员、夏冰清副研究员和程曦研究员为本文共同通讯作者。本研究工作得到了南京大学龙亿涛教授和应佚伦教授的支持和帮助。本研究获国家杰出青年基金、青促会创新基金、上海市糖专项、上海市科技创新行动计划基金、上海市启明星计划、上海市自然科学基金、国家重点实验室计划等项目的支持。

全文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c02081