嵌合抗原受体CAR-T细胞疗法在血液瘤治疗中已取得显著的治疗效果，但对实体瘤的治疗仍面临挑战。传统CAR-T细胞需体外扩增后回输，工艺复杂、成本高、周期长，且回输后难以有效浸润实体瘤，导致疗效受限。近年来，利用脂质纳米载体在体内直接生成CAR细胞成为新的研究方向，但如何实现“精准生成、局部激活、安全可控”仍是一大难题。因此，亟需开发一种既能精准靶向生成CAR-T/NK细胞,又具备良好安全性的新技术。

针对上述挑战，中国科学院上海药物研究所李亚平团队联合上海交通大学王当歌团队于2026年8月2日在Science Bulletin上发表了题为“In situ generation of NKG2D CAR T/NK cells via a tumor-targeted lipoplex for enhancing cancer immunotherapy”的研究成果。该研究开发了一种靶向代谢型谷氨酸受体4（GRM4）且具有肿瘤渗透能力的脂质递送系统（R₈L-NI@Lipo），通过递送乏氧响应的编码NKG2D-CAR和IL-15的pDNA实现肿瘤组织内部精准的CAR编译（图1）。R₈L-NI@Lipo通过R8促渗肽实现肿瘤深部渗透，利用LSOP分子靶向肿瘤组织GRM4受体实现肿瘤特异性富集，同时分泌IL-15实现对NK和CD8⁺T细胞的持续刺激。脂质递药系统荷载的pDNA含有9×HRE乏氧响应元件和ODD氧依赖降解结构域，确保CAR仅在肿瘤乏氧微环境中表达，降低了NKG2D-CAR在正常组织的非特异性表达。研究结果显示：在多种三阴性乳腺癌（TNBC）小鼠模型中，均可在肿瘤局部原位生成NKG2D CAR-T/NK细胞，重塑肿瘤免疫微环境，显著抑制肿瘤生长并延长生存期，同时有效避免肝脏等正常器官的脱靶毒性。

研究团队基于GRM4在乳腺癌组织及多种免疫细胞（T细胞、NK细胞等）中高表达的特征，选用含磷酸基团的GRM4激动剂L-O-磷酸丝氨酸（LSOP）修饰脂质体，并与带胍基的八聚精氨酸（R8）偶联，形成靶向GRM4且可穿透肿瘤血管屏障的LOSP修饰的R8肽偶联DSPE-PE二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG-R8L）载体。该载体可高效压缩携带piggyBac转座子系统的质粒pDNA（Dzr），该质粒编码NKG2D嵌合抗原受体（CAR）和IL-15，并受乏氧响应元件（HRE）和氧依赖降解结构域（ODD）的调控。体外和体内实验证实，仅在低氧（≤1% O₂）条件下NKG2D CAR才显著表达，在常氧下几乎沉默，从而实现了肿瘤乏氧微环境特异的CAR-T/NK细胞生成。相比常氧调控的对照质粒（Cme），R₈L-NI@Lipo递送的Dzr质粒显著减少了心、肝、脾、肺、肾等正常器官中的非特异性CAR表达，避免了白细胞减少和肝功能异常等毒性，同时转录组分析显示，该体系特异性激活抗原呈递、NK细胞毒性和补体级联等抗肿瘤免疫通路（图2）。在皮下4T1和EMT6小鼠模型中，R₈L-NI@Lipo显著增加肿瘤内NKG2D⁺ CD8⁺ T细胞和NK细胞浸润，提升颗粒酶B、IFN-γ等效应分子水平，诱导M1型巨噬细胞极化并减少调节性T细胞，重塑免疫微环境。治疗组肿瘤体积和重量显著下降（4T1模型中平均瘤重仅为对照组的9.2%），中位生存期从22.5天延长至42.5天（4T1）或44.5天（EMT6），部分小鼠实现完全缓解（图3）。本研究开发了一种靶向GRM4的肿瘤渗透性脂质复合物R₈L-NI@Lipo，其可在TNBC组织中实现乏氧响应性原位生成NKG2D CAR-T/NK细胞，为实体瘤的CAR免疫治疗提供了一种精准、安全、高效的原位生成新策略。

上海药物所李亚平研究员和上海交通大学王当歌研究员为本文的共同通讯作者。上海药物所博士研究生许晓轩、博士后易文哲，吉林大学博士研究生孙祥石为本文的共同第一作者。该研究得到了临港实验室科研任务、国家科技重大专项等项目的资助。

全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095927326008728

图1 具有肿瘤渗透性和乏氧微环境响应的脂质递药系统R₈-NI@Lipo的构建以及在实体瘤内部原位产生CAR-T/NK的原理

图2（a）来自TCGA的人乳腺癌（BRCA）与健康组织中GRM4的表达差异；（b）患者乳腺组织微阵列（n=40）中GRM4的免疫组化；（c）4T1肿瘤单细胞RNA测序的t-SNE及GRM4表达；（d）R₈L-NI@Lipo的制备流程；（e）粒径及透射电镜（TEM）；（f）DiR标记的R₈L-NI@Lipo随时间变化的活体荧光成像（λex/λem = 740/780 nm）；（g）注射后24 h的外渗图像，抗CD31抗体（绿色）；（h, i）piggyBac转座子质粒的构建；（j）常氧或缺氧处理48 h后，脾脏细胞上NKG2D CAR的流式细胞术检测（n=3）；（k）~100或200 mm³肿瘤中HIF-1α的丰度；（l）HIF-1α表达（n=3）；（m）R₈L-NI@Lipo处理后肿瘤切片的共定位图：EGFP（白色）、HIF-1α（绿色）、NKG2D（红色）、细胞核（蓝色）；（n）描绘区域内的信号强度；（o）PBS或R₈L-NI@Lipo预处理48 h后，脾细胞上NKG2D的表达（n=3）；（p）肿瘤中NKG2D的表达；（q, r）CD8⁺ T细胞（q）和NK细胞（r）中NKG2D CAR的变化倍数（n=3）；（s）48 h时肿瘤中IL-15的水平（n=3）。

图3（a–e）心脏（a）、肝脏（b）、脾脏（c）、肺（d）和肾脏（e）中免疫细胞上NKG2D CAR的表达（n=4）；（f）健康器官染色：IL-15（绿色）、NKG2D（红色）、细胞核（蓝色）；（g）白细胞（WBC）密度（n=5）；（h）血清中丙氨酸转氨酶（ALT）水平（n=5）；（i）治疗及分析时间线；PBS（G1）、NI（G2）、NI@Lipo（G3）、R₈-NI@Lipo（G4）、R₈L-I@Lipo（G5）、R₈L-N@Lipo（G6）和R8L-NI@Lipo（G7），每组n=4；（j–l）R₈L-NI@Lipo激活免疫的机制：NK细胞（j）、GzmB⁺ NK细胞（k）和IFN-γ⁺ NK细胞（l）；（m–p）肿瘤中免疫细胞百分比：CD8⁺ T细胞（m）、GzmB⁺ CD8⁺ T细胞（n）、IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞（o）和调节性T细胞（Tregs）（p）；（q）4T1肿瘤模型中的肿瘤生长曲线（n=6）；（r）第15天的肿瘤重量（n=6）；（s）生存曲线及中位生存时间（MST）；（t）EMT6肿瘤生长曲线（n=6）；（u）体重变化曲线（n=6）；（v）肿瘤生存曲线及MST。

（供稿部门：李亚平课题组；供稿人：易文哲；审核：刁文桐；责编：宋文珂）