hERG 测试

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化合物心脏安全性评价
  human Ether-a-go-go Related Gene (hERG) 安全性测试

药物安全性评价是药物研发过程中极其重要的一个步骤,随着一些非心血管类药物相继被发现会诱发获得性QT间期延长综合症(LQTS),导致严重的心律失常(Torsade de Pointes,TdP)而退出市场后,药物对心脏的安全性受到了更加广泛的重视。心脏的QT间期是指从QRS波群开始到T波结束的一段时间,包括心室去极化和复极化的过程,QT间期延长正受到越来越多的重视,并且被认为是新药安全性评价的关键指标之一。在心肌细胞中,human Ether-a-go-go Related Gene (hERG)编码的钾通道介导一种延迟整流钾电流(IKr),IKr抑制是药物导致QT间期延长最重要的机制(图1)。hERG因其特殊的分子结构,使其可被结构多样化的化合物抑制。目前,检测化合物对hERG钾通道的作用已是临床前评价化合物心脏安全性的关键步骤,也是FDA要求的新药报批必备资料。

  我们可采用三种技术方法测试化合物对hERG钾通道的作用,分别是全自动膜片钳技术(Automated Patch-Clamp),传统膜片钳技术(Conventional Patch-Clamp) 和FluxORTM Thallium Assay。

 

 

全自动膜片钳技术(hERG Qpatch assay)
传统膜片钳技术通过特制的玻璃管吸附于细胞表面,形成高阻抗千兆欧封接,可精确记录离子通道介导的电流的变化,被认为是研究离子通道的“金标准”,但其对操作人员的技术要求较高,通量低,无法满足目前药物研发对hERG毒性评价的大量需求。工作站引进的丹麦Sophion公司生产的Qpatch 16X,使用与传统膜片钳类似的玻璃制芯片,可形成千兆欧封接,在精确测量的前提下实现了高通量检测,每次可同步检测16个细胞。工作站开展hERG毒性评价的团队成员有十年以上的电生理工作经验,从事hERG毒性评价超过五年,经验丰富。工作站的hERG评价采用基于GLP规范的标准流程,各项指标达到或超过新药申报要求的标准。为更好的为药物研发工作提供支撑,工作站hERG评价体系面向所内外科研机构和药物研发企业提供测试服务,目前已完成包括德尼替丁等一类新药在内的数百个化合物检测,出具的检测报告获得中国FDA的通过。
 
传统膜片钳技术(hERG manual patch-clamp asssay)
膜片钳技术(Conventional Patch-Clamp) 是研究离子通道最重要的技术手段,被公认为是离子通道研究的“黄金标准”,是最精确的测量离子通道的实验方法,适用于研究化合物与离子通道作用的作用机制,亦可用于新药申报过程中候选药物的毒性评价和先导化合物的结构优化。
Cisapride抑制hERG钾电流的电流图和hERG峰电流与时间关系图
 

Cisapride抑制hERG钾电流的剂量反应曲线。

FluxORTM Thallium Assay

Thallium assay 使用FluxORTM荧光染料发光的方法测试化合物对hERG钾通道的影响。对铊敏感的荧光染料被加载到细胞膜内,细胞外的铊离子通过开放的hERG钾离子通道顺浓度梯度进入细胞内,与荧光染料结合后产生荧光(图 3)。FluxORTM thallium assay 在国际上已经被制药公司及科研机构广泛用于化合物hERG活性检测,因其可以在96孔板或384孔板上进行测试,达到高通量的要求,适用于化合物初筛及先导化合物优化。

图 3:Thallium Assay 原理。当细胞外高浓度的铊离子通过开放的离子通道进入胞内后与荧光染料结合发出荧光。

 

图 4:Thallium Assay 原理。当细胞外高浓度的铊离子通过开放的离子通道进入胞内后与荧光染料结合发出荧光。